Protéomique du lysosome: caractérisation d'un candidat protéiné de la membrane des lysosomes

Résumé

Dans le but d'élargir les connaissances actuelles sur les lysosomes, l'équipe du Professeur Garin (Grenoble), tente d'identifier de nouvelles protéines membranaires Iysosomales à partir de fractions de foie de rat enrichies en lysosomes. Au sein de ces
fractions préparées dans notre laboratoire, ce sont principalement les protéines les plus hydrophobes qui sont ciblées et identifiées par spectrométrie de masse. Parmi les molécules identifiées lors de ces travaux, se trouve une protéine inconnue d'un poids moléculaire théorique de 40 kDa (p40) qui mérite toute notre attention puisque l'analyse de sa séquence révèle plusieurs segments hydrophobes ainsi que d'éventuels motifs d'adressage aux lysosomes (motifs di -leucine et tyrosine). Notre mémoire à été consacré à l'étude de l'insertion membranaire de P40 ainsi que sa topologie, le nombre exact de segments transmembranaires ainsi que l'orientation des extrémités N- et C-terminales étant incertains. Afin de répondre à ces questions, nous avons produit diverses constructions moléculaires : d'une part, nous avons créé 2 mutants de glycosylation en insérant des sites consensus de glycosylation dans les 2 premières boucles hydrophiles de la protéine et, d'autre part, nous avons greffé la GFP aux 2 extrémités de p40.
Nous avons utilisé un système de traduction in vitro, en présence ou en absence de microsomes pour étudier la synthèse de ces protéines. Les produits de traduction ont été analysés par partition dans le Triton X-114, extraction des membranes à l'aide de carbonate pH 11.5 et digestion par la protéinase K et par la trypsine. Nous avons montré que les sites potentiels de glycosylation de p40 ne sont pas utilisés. L'absence de glycosylation des mutants obtenus par l'insertion de deux sites de glycosylation supplémentaires rend plus difficile encore l'élaboration d'un modèle topologique définitif. Toutefois, de l 'ensemble de nos résultats, nous pouvons conclure que p40 est une protéine très hydrophobe, associée aux membranes et dont les extrémités N- et C-terminales pourraient être externes, c'est-à-dire cytoplasmique dans le contexte cellulaire

la date de réponse	2004
langue originale	Français
Superviseur	Michel Jadot (Promoteur)