Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, l’agent étiologique de l’entérite chronique de l’intestin grêle chez les ruminants domestiques et sauvages, cause d’importantes pertes à l’industrie de bétail. Le contrôle de cette maladie est sérieusement entravé par le manque d’outils de diagnostic et de vaccins appropriés. Les vaccins de la première génération, constitués par des combinaisons de mycobactéries entières (tuées ou vivantes-atténuées) en adjuvant huileux confèrent une protection partielle, en retardant l’excrétion des mycobactéries dans les fèces et en réduisant le nombre d’animaux dans la phase clinique. Toutefois, ils interfèrent dans le test de diagnostic de la tuberculose bovine ce qui rend impossible leur utilisation chez le bovin. Il est important de développer des vaccins de nouvelle génération qui protégeront mieux de l’infection et qui n’interféreront pas avec les tests de dépistage de la tuberculose et de la paratuberculose. M. paratuberculosis appartient au groupe des mycobactéries à croissance lente, ayant besoin de 6 à 8 semaines de culture avant de pouvoir visualiser les colonies sur un milieu solide. Cette particularité est un frein aux études d’infection, d’immunologie et de vaccination. Afin de faciliter l’étude de nouveaux vaccins, nous avons développé une souche de M. paratuberculosis luminescent exprimant les gènes de luxAB de Vibrio harveyi et nous avons décrit son utilisation lors d’un essai de vaccination dans un modèle expérimental murin, remplaçant ainsi l’énumération fastidieuse et coûteuse des CFU par la technique de luminométrie très rapide et facile. En utilisant cette souche luminescente, nous avons ainsi réévalué l’effet du polymorphisme du gène murin Slc11a1 (anciennement appelé Nramp1) sur la susceptibilité à M. paratuberculosis. Une série de souris consanguines (« inbred ») ont été infectées par voie intraveineuse avec la souche de M. paratuberculosis S-23 luminescente et la charge bactérienne dans la rate, le foie, et les poumons de chaque animal a été suivie pendant 12 semaines. Les résultats confirment que, comme pour M. avium, la résistance innée à l’infection est génétiquement contrôlée par le gène Slc11a1. Chez les souris BALB/cH-2d, les souris congéniques BALB.B10 H-2b (fond génétique des BALB/c ; H-2b), les souris C57BL/6 H-2b, et les souris beiges C57BL/6bg/bg (tous Slc11a1s) le nombre de bactéries dans la rate et le foie n’a pas changé lors des 4 premières semaines de l’infection. Chez les souris DBA/2, les souris congéniques BALB/c.DBA/2 (C.D2) (homozygotes pour l’allèle de résistance Slc11a1r) et les souris (C57BL/6 × DBA/2)F1 (hétérozygotes, Slc11a1s/r), le nombre de bactéries a diminué plus de 10 fois à 4 semaines post-infection aussi bien chez les souris mâles que chez les souris femelles. A des temps plus tardifs, des différences supplémentaires ont été observées dans la réplication bactérienne entre les lignées de souris susceptibles et plus particulièrement dans le foie. Alors que la charge bactérienne diminuait plus de 100 fois chez les souris C57BL/6 entre 4ème et la 12ème semaine, le nombre de bactéries restait stable dans le foie des souris BALB/c et des souris beiges C57BL/6bg/bg. La production spécifique d’IFN-γ s’est développée plus tôt et plus fortement chez les souris C57BL/6 comparée à celle observée chez les souris BALB/c et elle était la plus faible chez les souris C.D2, résistantes à l’infection. Dans notre recherche de nouveaux candidats, nous avons évalué l’immunogénicité et le potentiel vaccinal de dix protéines spécifiques de M. paratuberculosis, identifiés par deux différentes approches. La première a consisté en l’identification systématique des protéines du filtrat de culture de M. paratuberculosis, suivie par la sélection des protéines spécifiques par le programme BLAST sur les génomes mycobactériens disponibles et à une analyse immuno-protéomique des protéines du filtrat de culture et d’extrait de M. paratuberculosis en utilisant des sérums de bovins infectés par M. paratuberculosis et par M. bovis. La troisème approche « in silico » a consisté en la sélection de séquences spécifiques de M. paratuberculosis par comparaison avec l’ensemble des génomes mycobactériens disponibles et, seules les séquences n’ayant pas d’homologies significatives ont été sélectionnées. Enfin, une dernière sélection a été effectuée en utilisant trois programmes de prédiction d’épitope pouvant être présentés aux cellules T : « Tsites », « BIMAS » et « SYFPEITHI » afin de choisir les séquences prédites les plus immunogéniques pour le développement d’un futur vaccin. Les dix candidats choisis étaient MAP0586c, MAP4308c, MAP1693c, Ag3 (CF036), MAP2677c, (identifiés par l’analyse protéomique et immuno-protéomique) et l’Ag5, Ag6, MAP1637c, MAP0388 et MAP3743 (identifiés par l’analyse « in silico »). Chaque antigène a été cloné dans le vecteur d’expression eucaryote V1.Jns-tPA et les plasmides ont été utilisés pour vacciner des souris BALB/c et C57BL/6. La vaccination à ADN plasmidique est un outil puissant et facile par sa capacité de cribler à haut débit le potentiel vaccinal d’antigènes protéiques. De plus, les vaccins à ADN plasmidiques sont particulièrement prometteurs pour la prévention des infections provoquées par les agents pathogènes intracellulaires, grâce à leur capacité à induire de fortes réponses immunes de type cellulaire Th1 sans l’utilisation supplémentaire d’adjuvants. D’autre part, chaque candidat a aussi été cloné dans le vecteur d’expression procaryote pQE-80L afin de purifier les 10 protéines recombinantes contenant une queue hexa-histidine en position amino-terminale NH2 par une chromatographie d’affinité d’ions métalliques immobilisés (IMAC). De fortes réponses spécifiques d’IFN-γ et d’IL-2 ont été induites chez les souris vaccinées par les ADN plasmidiques codant pour MAP0586c, MAP4308c, MAP1693c, MAP1637c, MAP0388 et MAP3743. En contraste, les réponses T induites chez les souris infectées par M. paratuberculosis ont été dirigées préférentiellement contre MAP0586c et Ag5 et dans une moindre mesure contre MAP3743. La vaccination avec l’ADN plasmidique codant pour MAP0586c induisait un très faible niveau d’anticorps IgG1 chez les souris C57BL/6 et BALB/c. La vaccination avec les ADN plasmidiques codant pour MAP4308c, MAP1693c et MAP2677c stimulait la production d’anticorps chez les deux lignées de souris. Les souris BALB/c vaccinées présentaient aussi de plus faibles niveaux d’anticorps contre trois protéines identifiées i.e. Ag5, Ag6 et MAP1637c. En conclusion, un des vaccins à ADN plasmidique, i.e. celui codant pour MAP0586c, une possible transglycosylase, a conféré une protection chez les souris BALB/ contre une infection avec M. paratuberculosis et ceci avec la même performance que le vaccin Mycobacterium bovis BCG, indiquant que ce candidat vaccinal est intéressant et qu’il nécessite de futures investigations.
| la date de réponse | 16 mars 2012 |
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| langue originale | Français |
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| L'institution diplômante | |
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| Superviseur | JEAN-JACQUES LETESSON (Promoteur), Benoit Muylkens (Président), Kris Huygen (Jury), Ruddy Wattiez (Jury) & Lieve HERMAN (Jury) |
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