Effets du donneur de peroxynitrite, la 3-morpholinosydnonimine, sur les cellules endothéliales: rôle du facteur de transcription Nrf2 et de la voie UPR

Résumé

En conditions physiologiques, les cellules endothéliales produisent des anions superoxyde (O2•-) et du monoxyde d’azote (NO). Les O2•- sont des précurseurs, entre autres, du peroxyde d’hydrogène, impliqué dans des processus de signalisation aboutissant à des régulations d’expression génique. A plus forte concentration, le peroxyde d’hydrogène favorise la formation de radicaux hydroxyl, cytotoxiques. Le NO, quant à lui, a une action bénéfique reconnue sur le système cardiovasculaire en induisant notamment la relaxation des cellules musculaires lisses. Mais lorsque la concentration en NO est trop importante, il entre en compétition avec les superoxyde dismutases et réagit avec les O2•- pour former le peroxynitrite. Ce dernier est une molécule hautement réactionnelle, réagissant avec les acides gras, les acides nucléiques et les protéines (avec par exemple, la formation de 3-nitrotyrosines) et impliquée dans le dysfonctionnement endothélial, phénomène à la base des maladies cardiovasculaires. Les espèces réactives de l’oxygène ou de l’azote peuvent donc, selon les conditions, jouer un rôle de messagers secondaires à faible concentration ou de molécules toxiques induisant un stress oxydatif à plus forte concentration. En conditions normales, la production de peroxynitrite est faible et les dommages qu’il pourrait induire sont limités par divers systèmes de défense. Parmi ces moyens de défense, il y a la voie du facteur de transcription Nrf2 (« nuclear transcription factor erythroid 2p45 – related factor ») et la voie UPR (« Unfolded Protein Response »). Nrf2 est un facteur de transcription qui répond aux stress oxydatifs et régule l’expression des gènes codant pour des protéines anti-oxydantes ou détoxifiantes telles que l’hème oxygénase-1 (HO-1) ou la NAD(P)H quinone oxydoréductase 1 (NQO1). La voie UPR est une voie de signalisation intracellulaire cytoprotectrice activée par l’accumulation de protéines mal repliées dans le réticulum endoplasmique aboutissant à l’activation de divers acteurs moléculaires dont la kinase PERK et le facteur de transcription ATF6. La voie UPR a pour but d’augmenter la synthèse des chaperonnes dont BiP et Grp94, et ainsi d’augmenter la capacité de bien replier et d’éliminer les protéines mal repliées. Cependant, si le stress est trop intense ou de trop longue durée, la voie UPR peut induire la mort cellulaire par apoptose notamment via le facteur de transcription CHOP (« CAAT/Enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein »). L’objectif de ce travail de thèse était de mieux comprendre les effets du peroxynitrite dans les cellules endothéliales, en discriminant d’une part sa fonction de messager secondaire déclenchant des réponses de défense au stress, et d’autre part, sa toxicité pouvant mener à l’apoptose. Pour ce faire, nous avons choisi un système expérimental de formation de peroxynitrite, le SIN-1 (3-morpholinosydnonimine). Nous avons aussi essayé de mettre au point différents systèmes dits « plus physiologiques » de génération de peroxynitrite in vitro. Parmi les systèmes décrits pour générer du peroxynitrite, nous avons choisi l’homocystéine, l’hypoxie/réoxygénation, les LDL oxydées et l’angiotensine-II. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle expérimental d’exposition des cellules endothéliales au peroxynitrite en incubant des cellules endothéliales humaines en culture (lignée EAhy926 et cellules en primo-culture HUVEC) en présence de SIN-1. Dans un premier temps, nous avons testé la cytotoxicité du SIN-1 et nous avons caractérisé la formation de peroxynitrite à partir de SIN-1 dans ces modèles cellulaires en suivant l’oxydation de la sonde hydroxyphényl fluorescéine et la formation de 3-nitrotyrosines par une analyse en Western blot avec des anticorps dirigés contre les 3-nitrotyrosines. Dans un second temps, nous avons mis en évidence l’activation de la voie Nrf2 et de la voie UPR par le SIN-1 et nous avons démontré que le SIN-1 exerce un effet protecteur dans les cellules EAhy926 soumises à une privation de sérum. En décortiquant les mécanismes moléculaires impliqués dans l’effet cytoprotecteur du SIN-1, nous avons constaté que, via les protéines Nrf2 et HO-1, le SIN-1 induit une diminution de la fragmentation de l’ADN et une augmentation de la formation de LC3-II dans les cellules endothéliales soumises à une privation de sérum. Au cours de ce travail, nous avons également évalué l’effet de conditions particulières (homocystéine, hypoxie/réoxygénation, LDL oxydées et angiotensine-II) sur la formation de peroxynitrite. Il semblerait que ce dernier soit généré en présence de LDL oxydées et d’angiotensine-II combinée à un donneur de NO. Toutefois, de plus amples investigations sont encore nécessaires afin de pouvoir optimaliser ces conditions dites « plus physiologiques » sur la formation de peroxynitrite et confirmer l’effet cytoprotecteur du peroxynitrite observé dans des cellules endothéliales soumises à une privation de sérum et exposées au SIN-1. Les résultats obtenus au cours de ce travail montrent donc que, dans une gamme de concentration étroite, le peroxynitrite formé suite à la stimulation des cellules endothéliales avec le SIN-1, permet de les protéger contre la toxicité induite par une privation de sérum, que la stimulation avec le SIN-1 soit réalisée après ou avant la privation de sérum, cette dernière condition se rapprochant des expériences dites de conditionnement in vivo. Ce travail nous a donc permis de mieux comprendre l’équilibre entre les signaux de survie ou de mort cellulaires déclenchés par le peroxynitrite et de préciser dans quelles conditions cet équilibre bascule vers la mort des cellules endothéliales, dans le contexte du dysfonctionnement endothélial, impliqué dans les étapes précoces de l’athérosclérose. Il suggère également qu’une thérapie anti-oxydante trop drastique des maladies cardiovasculaires risque de supprimer les actions positives des espèces réactives de l’oxygène et des espèces réactives de l’azote présents en faible concentration.

la date de réponse	2 mars 2012
langue originale	Français
L'institution diplômante	Universite de Namur
Superviseur	Martine Raes (Promoteur), Isabelle Hamer (Jury), Carine Michiels (Jury), Xavier De Bolle (Président), Chantal Dessy (Jury) & KZ Boudjeltia (Jury)