Caractérisation de p40, une protéine identifiée dans une préparation de membranes lysosomales

Résumé

Le lysosome est un organite acide qui contient de nombreuses hydrolases responsables de la dégradation d’une grande variété de molécules issues majoritairement des voies d’endocytose et d’autophagie. La membrane de l’organite contient, elle aussi, un certain nombre de protéines qui assurent diverses fonctions telles que la génération d’un gradient de pH intralysosomal, la translocation de produits de dégradation vers le cytosol, la régulation des contacts membranaires, etc. Cependant, au vu de la grande diversité des produits générés par l’hydrolyse intralysosomale et susceptibles d’être transportés vers le cytosol, et de la complexité des mécanismes de contact/fusion/fission qui impliquent la membrane lysosomale, il est hautement probable que de nombreuses protéines membranaires restent à être identifiées. Nous avons mis en évidence un nouveau candidat membranaire lysosomal au cours d’une analyse protéomique réalisée sur des fractions enrichies en membranes de lysosomes. Cette protéine de 372 acides aminés, que nous avons dénommée p40, présente de nombreux segments transmembranaires prédits, quatre motifs potentiels d’adressage aux lysosomes et une homologie de séquence partielle avec des transporteurs de sucres nucléotidylés. Nous avons recherché la localisation de p40 dans la cellule par des techniques de fractionnement subcellulaire, appliquées sur le foie de souris. Nous avons comparé la distribution de cette protéine au sein des fractions obtenues par centrifugation différentielle et par centrifugation isopycnique sur un gradient continu de saccharose (avec et sans traitement préalable de la souris avec du Triton WR-1339) à celles de protéines marqueurs des organites. Nous avons combiné cette approche à une analyse morphologique par microscopie à fluorescence confocale de la localisation de p40 dans des cellules eucaryotes transfectées. Nos résultats nous ont permis de démontrer la localisation lysosomale de p40. D’autre part, nous avons mis en évidence que le temps de demi-vie de p40 est d’environ 10 heures et que p40 est une protéine d��pourvue de chaînes oligosaccharidiques, fortement associée aux membranes. Nous avons ensuite entrepris de rechercher une possible activité de transport pour p40, suggérée par l’homologie de séquence détectée avec des transporteurs connus. Pour cela, nous avons utilisé une technique d’électrophysiologie perfectionnée, bien adaptée à la réalisation d’un large criblage de substrats potentiels d’une hypothétique activité de transport. Bien que nous ayons testé près de 70 composés au total, nous n’avons pas mis en évidence la fonction de p40 par cette approche. Dans un troisième temps, nous nous sommes intéressés à la façon dont la protéine p40 néosynthétisée est spécifiquement ciblée vers les lysosomes. Nous avons muté les quatre motifs potentiels d’adressage aux lysosomes présents dans la séquence de p40 et nous avons observé l’impact de ces mutations sur sa localisation subcellulaire. Ces travaux ont révélé que l’envoi de p40 vers les lysosomes est assuré par un signal de type “ dileucine “ situé 11 résidus en amont de l’extrémité C-terminale de la protéine : le motif EQERL360L361. En effet, la substitution des deux résidus leucine critiques par d’autres acides aminés abolit le transport de la protéine p40 vers les lysosomes et induisait son envoi vers la membrane plasmique. En conclusion, notre recherche visant à caractériser p40 montre que cette protéine nouvellement identifiée est une protéine membranaire lysosomale non glycosylée, ciblée vers les lysosomes à partir du TGN par un signal d’adressage EQERL360L361 localisé dans sa queue C-terminale. Des études complémentaires sont nécessaires afin de cerner la fonction assurée par p40 au sein de la membrane des lysosomes

la date de réponse	20 déc. 2007
langue originale	Français
L'institution diplômante	Universite de Namur
Superviseur	Michel Jadot (Promoteur), Yves Poumay (Jury), Bruno Flamion (Jury), Marie-France VAN DEN HOVE VANDENBROUCKE (Jury), Bruno GASNIER (Jury) & Jérôme GARIN (Jury)